연합뉴스 20151113 게재 사진

 

한국연구재단(이사장 정민근)은 국내 연구진이 줄기세포 치료를 위한 세포 배양 시에 얇고 기공이 넓어서 특정 세포로의 분화 효율이 크게 향상된 다공성 나노 분리막*을 개발했다고 밝혔다.

* 분리막(멤브레인, membrane) : 액체 또는 기체의 특정성분을 선별적으로 통과시켜 혼합물을 분리할 수 있는 액체막 또는 고체막으로 필터역할을 한다

 

서울대 김병수 교수, 차국헌 교수 연구팀은 줄기세포 배양에 응용할 수 있는 나노 분리막에 관한 연구를 미래창조과학부와 한국연구재단이 지원하는 리더연구자지원사업을 통해 수행, 연구결과는 에이시에스나노(ACS Nano) 9월 11일 자 온라인판에 게재되었으며 케미컬앤엔지니어링 뉴스(Chemical&Engineering News) 10월 2일자에 관련 논문에 대한 상세한 기사가 소개되었다.

 

논문명과 저자 정보는 다음과 같다.

- 논문명 : Nanothin Coculture Membranes with Tunable Pore Architecture and Thermoresponsive Functionality for Transfer-Printable Stem Cell-Derived Cardiac Sheets

- 저자 정보 : 김병수 교수(교신저자, 서울대), 차국헌 교수(공동 교신저자, 서울대), 유승미 박사과정(제1저자, 서울대), 류진 박사과정(공동 제1저자, 서울대)

논문의 주요 내용은 다음과 같다.

 

1. 연구의 필요성

○ 줄기세포는 다분화능*으로 인해 다양한 질병 치료의 해결책으로 많은 주목을 받고 있으나 줄기세포 치료제를 인체에 직접 주입하면, 분화 효율이 낮고 암세포로 변하거나 다른 부위로 이동해 원치 않은 세포로 자라날 우려가 있다.

＊다분화능 : 줄기세포의 대표적인 특징으로 여러 종류의 세포로 자라날 수 있는 능력

○ 줄기세포를 원하는 세포로 키운 후 사용하는 방법 가운데 줄기세포와 특정세포 사이에 분리막(멤브레인)을 두어 줄기세포를 공배양*하는 방법은 세포가 특정 세포 쪽으로 분화하는데 필요한 고가의 단백질이나 신호물질을 따로 넣어주지 않아도 함께 자라는 세포와 상호작용을 통해 얻을 수 있기 때문에 효율적이고 경제적이다. 그러나 기존 멤브레인은 공극률**이 낮고(2% 정도), 두께가 두꺼워(10㎛ 정도) 세포 간 상호작용이 활발하지 못했다.

* 공배양 : 두 가지 이상의 세포를 동시에 키우는 기술

** 공극률: 전체 면적 중에 기공이 차지하는 면적비

 

2. 발견 원리

○ 셀룰로즈 아세테이트*를 테트라하이드로퓨란(THF)**에 녹인 용액을 비용매인 수증기가 많은 환경에 노출시키면, 용액이 셀룰로즈 아세테이트가 많은 부분과 적은 부분으로 나뉘면서 비균질해진다. 이후 스핀공정을 통해 용매를 제거하면 셀룰로즈 아세테이트가 많은 부분은 막이 되고, 적은 부분은 구멍이 되면서 구멍이 무수히 많은 수 백 나노미터 두께의 분리막이 형성된다.

* 셀룰로즈 아세테이트 : 셀룰로스의 일부를 변형시킨 고분자로 생체 친화적이며 물에 녹지 않음

** 테트라하이드로퓨란 : 여러 종류의 고분자를 녹일 수 있어 널리 쓰이는 용매 중 하나

 

○ 개발한 분리막은 얇고(380nm, 기존의 20배 정도) 공극률이 높아(52%, 기존의 25배 이상) 세포 공배양시 배양하는 두 세포간의 신호물질 교환에 유리하고 직접적인 상호작용까지 가능하여 분화 효능이 높다. 또한 온도를 낮추는 것만으로 세포는 물론 분리막에 아무런 손상도 주지 않고 세포를 시트 형태로 분리해낼 수 있다. 또한 개발한 분리막을 이용해 줄기세포를 심근세포로 분화시켰을 때 기존보다 최소2배~8배의 효율을 보였다.

 

3. 연구 성과

○ 공배양 시 분리 효율과 세포 간 상호작용을 동시에 극대화하는 최적의 기공 크기를 가진 분리막을 개발했다. 이를 이용하여 줄기세포를 효과적, 그리고 경제적으로 분화시킬 수 있는 플랫폼을 제공하였다.

 

김병수, 차국헌 교수는 “본 연구결과는 다양한 종의 세포를 줄기세포와 공배양하여 다양한 3D 형태의 다층 분화 세포 시트를 얻을 수 있는 플랫폼 기술로서 나노스케일의 세포 간 상호작용 연구에 도움을 주는 등 줄기세포를 비롯한 세포연구 분야에 중요한 실마리와 유용한 도구를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.”라고 연구의 의의를 밝혔다.

 

 

연 구 결 과 개 요

 

1. 연구배경

ㅇ 신체에 존재하는 200개 세포 유형 중 하나로 자체 성장할 수 있는 능력을 지닌 줄기세포는 당뇨병, 백혈병, 파킨슨병, 심장병, 척수외상을 비롯한 수많은 치명적 질환의 치료법으로 최근 각광받고 있다. 이렇듯 줄기세포는 다분화능을 지니지만, 줄기세포를 주입한 뒤 분화효율이 낮고 암세포로 변질될 가능성으로 인해 끊임없는 우려가 제기되고 있다. 따라서 이식 전에 원하는 세포 종으로 분화시킨 줄기세포 치료제에 대한 연구가 중요한 관심사 중의 하나이다. 본 연구에서는 줄기세포를 효과적이고 경제적으로 분화시킬 수 있는 방법인 공배양을 이용하여 원하는 세포로 분화된 세포 시트를 손쉽게 얻을 수 있는 방법을 보고하였다. 또한, 이번 연구를 통해 개발한 다공성 나노멤브레인은 기공 크기 및 공극률을 조절할 수 있기 때문에 세포간의 주고받는 신호물질 단백질부터 세포간 협간극 결합을 통한 직접적인 교류까지 다룰 수 있다는 점에서 나노스케일의 세포간 상호작용을 조절 및 분석할 수 있는 기틀을 마련하였다.

 

2. 연구내용

ㅇ 본 연구에서는 비용매 기체유도 상분리 공정(VIPS)의 원리를 이용하여 멤브레인의 주 재료인 셀룰로즈 아세테이트를 용매인 테트라하이드로퓨란(THF)에 녹이고, 비용매인 물(수증기 기체)이 많은 환경에 노출시켜 상분리를 유도한 후, 스핀공정을 통해 용매를 추출하여 멤브레인에 높은 밀도의 기공을 부여하였다.(셀룰로즈 아세테이트가 많은 부분과 적은 부분으로 상이 분리되는데, 용매가 증발하면서 셀룰로즈 아세테이트가 많은 부분은 멤브레인을 형성하고 그 반대 상은 구멍을 형성하게 된다.) 셀룰로즈 아세테이트는 기계적 물성이 높고 안정성이 높은 동시에 생체 친화적인 고분자이기 때문에 세포 배양막으로서 활용도가 높다.

ㅇ 본 연구에서 개발된 다공성 나노멤브레인은 제조공정 중의 다양한 실험인자를 통해 기공의 크기를 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 분리효율과 세포간 상호작용을 동시에 극대화하는 최적의 기공 크기를 찾아낼 수 있었다. 또한, 스핀공정을 통해 멤브레인의 두께를 수백 나노미터(nm) 수준으로 구현함으로써, 공배양하는 세포간 거리를 최소화시켰다.

 

o 본 연구에서 사용된 나노멤브레인은 NTHP 멤브레인이라고 명명되었 는데, 그 이유는 Nano-Thin(나노스케일 두께)하며 Highly Porous(높 은 공극률) 한 특성을 지닌 멤브레인이기 때문이다.

ㅇ 최적의 다공성 멤브레인을 이용하여 줄기세포를 원하는 유형의 세포(쥐에서 추출한 심근세포)와 공배양함으로써 줄기세포를 효과적으로 심근세포로 분화를 유도하였다. 공배양하는 이종세포 사이에 나노 멤브레인이라는 물리적 장벽이 있음에도 두께가 매우 얇고 공극률이 높기 때문에 세포간 상호작용을 극대화하여 높은 분화효율을 얻을 수 있었다. 또한, 본 멤브레인은 탈/흡착이 쉽고 온도감응성을 지니는 특징으로 인해 분화된 세포를 세포 외 기질물질의 파괴 없이 시트 형태로 쉽게 얻어낼 수 있다.즉, 온도에 반응하는 고분자로 멤브레인의 표면을 개질한 후, 위에 세포를 키운 후 온도를 낮추게 되면 고분자의 물성이 변하면서 고분자 위에 있던 세포가 시트형태로 떨어져 나가게 된다.

ㅇ 이렇게 얻은 셀 시트는 이식 후 생존율을 높임으로써 개선된 치료효과를 기대할 수 있을 뿐만 아니라, 다층의 셀 시트를 구축함으로써 삼차원 형태의 분화된 세포구조를 얻을 수 있기 때문에 향후 줄기세포를 이용한 치료제로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상한다.

 

3. 기대효과

ㅇ 본 연구는 나노멤브레인을 이용한 공배양 실험을 통해 높은 분화효율을 보이는 3차원의 세포 시트 구조체를 구현하였을 뿐만 아니라, 기공의 크기를 조절하여 세포간 신호물질을 주고받는 것은 물론 세포간 직접적인 접촉까지 포함하는 세포간 상호작용을 분석할 수 있는 플랫폼을 제공하였고, 이는 줄기세포를 이용한 치료법과 세포간 상호작용을 이해하는데 있어 큰 의의가 있다.

ㅇ 이와 같은 플랫폼 기술은 다양한 종의 세포를 줄기세포와의 공배양에 적용함으로써 특정 세포에 구애받지 않고 여러 종류의 다층 분화 세포 시트를 얻을 수 있기 때문에 줄기세포 치료에 적용될 수 있는 뛰어난 잠재력을 가지고 있고, 다양한 바이오 응용분야 연구에 유용한 도구(플랫폼 기술)를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.

 

 

★ 연구 이야기 ★

 

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

 

기존의 세포 공배양 시스템을 줄기세포의 분화에 적용하기에는 효율이 낮고 분화된 세포의 회수가 번거롭다는 단점이 있기 때문에, 이를 극복하는 방법에 대한 연구가 필요하다고 생각하여 연구를 시작하였다. 세포간 상호작용과 분리효율을 동시에 극대화 시킬 수 있는 최적 실험조건을 찾기 위해 기공 크기 조절이 필요하다고 생각하여 다양한 실험인자들을 변화시켜 가며 줄기세포 분화에 쉽게 적용 가능한 최적의 공배양 시스템을 찾고자 하는 방향으로 연구를 진행하였다.

 

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

 

본 연구팀은 분리효율은 높으면서도 동시에 세포간 상호작용은 극대화시킬 수 있으며, 세포 배양에 용이한 기계적 물성과 안정성을 지닌 고분자 멤브레인을 개발하였다. 멤브레인의 공극이 너무 작을 경우, 세포간 집적적인 접촉이 불가능하여서 수용액 내의 신호물질을 통한 교류만이 가능하여 세포간 상호작용을 극대화하는데 한계가 있다. 반면, 공극이 너무 클 경우는 세포간 교류는 활발하지만 세포간 이동으로 인해 분리효율이 떨어지며 이는 이종세포간 공배양에서 큰 문제점으로 작용할 수 있다. 따라서 세포간 상호작용과 분리효율이라는 두 가지 문제를 동시에 충족시킬 수 있는 최적의 공극의 크기를 찾아 줄기세포 분화에 적용하였다. 또한, 기상 개시 중합반응(initiated chemical vapor deposition, iCVD)을 이용하여 나노크기의 기공을 막지 않고 온도감응성 고분자를 나노 멤브레인의 표면에 증착시킴으로써 나노멤브레인에 온도감응 기능성을 부여하였다. 온도감응을 지니는 특성으로 인해 분화된 세포를 세포외 기질 물질의 파괴없이 시트 형태로 쉽게 얻어낼 수 있다. 이렇게 얻은 셀 시트는 이식 후 생존율을 높임으로써 개선된 치료효과를 기대할 수 있을 뿐만 아니라, 다층의 셀 시트를 구축함으로써 삼차원 형태의 분화된 세포구조를 얻을 수 있었다.

 

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

 

다공성 나노 멤브레인을 이용하여 세포간 상호작용을 극대화하여 분화효율을 높이는 방향으로 연구를 진행하였다. 하지만 이렇게 분화된 세포를 트립신 처리를 통해 수득할 경우 세포 생존율이 낮아 이식 후 좋은 효과를 기대할 수 없을 것이라 생각하였다. 따라서 기존에 잘 알려진 Okano 교수의 셀 시트처럼 분화된 세포를 시트형태로 떼어내고자 하였다. 이를 위해서는 멤브레인의 표면 개질이 필요하였다. 하지만 나노 크기의 수많은 기공을 갖는 다공성 멤브레인의 표면 구조를 해치지 않고 온도 감응성 고분자를 치환하는 것이 쉽지 않았다. 그러던 중 기상 개시 중합반응을 이용하여 다양한 나노구조에도 conformal하게 고분자를 증착시킬 수 있는 카이스트 실험실의 도움으로 멤브레인의 표면에 온도감응성 고분자를 증착할 수 있었고, 이를 통해 분화된 세포 시트를 얻음으로써 우리 플랫폼의 강점을 극대화할 수 있었다.

 

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

 

기존의 세포 공배양 시스템의 한계점을 극복하는 나노멤브레인을 개발하여 공배양에 적용함으로써 이종세포 간 혼합은 방지하면서 세포간 상호작용은 극대화하였다. 최적 조건의 나노멤브레인을 줄기세포와 쥐에서 추출한 심근세포의 공배양에 적용하여 효과적으로 줄기세포를 심근세포로 분화시켰다. 또한, 나노멤브레인의 표면에 온도감응성을 부여함으로써 다층의 세포 시트를 구현함으로써 이식 후의 높은 치료효과를 기대할 수 있다. 뿐만 아니라, 기공의 크기를 조절하여 세포간 주고받는 신호물질에서 세포간 직접적인 접촉까지 포함하는 나노스케일의 세포간 상호작용을 분석할 수 있는 플랫폼을 제공하였다는 점이 나노과학 분야에서 매우 괄목할만한 성과라 할 수 있다.

 

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

 

다양한 종의 세포를 줄기세포와의 공배양에 적용함으로써 특정 세포에 구애받지 않고 여러 종류의 다층 분화 세포 시트를 얻을 수 있기 때문에 줄기세포 치료에 적용될 수 있는 뛰어난 잠재력을 가지고 있다. 따라서 이 플랫폼을 각종 질병을 치료하는데 적용 가능해지길 바란다.

 

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

 

기존의 세포 공배양 시스템을 줄기세포의 분화에 적용하기에는 효율이 낮고 분화된 세포의 회수가 번거롭다는 단점이 있기 때문에, 이를 극복하는 방법에 대한 연구가 필요하다고 생각하여 연구를 시작하였다. 세포간 상호작용과 분리효율을 동시에 극대화 시킬 수 있는 최적 실험조건을 찾기 위해 기공 크기 조절이 필요하다고 생각하여 다양한 실험인자들을 변화시켜 가며 줄기세포 분화에 쉽게 적용 가능한 최적의 공배양 시스템을 찾고자 하는 방향으로 연구를 진행하였다.

 

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

 

본 연구팀은 분리효율은 높으면서도 동시에 세포간 상호작용은 극대화시킬 수 있으며, 세포 배양에 용이한 기계적 물성과 안정성을 지닌 고분자 멤브레인을 개발하였다. 멤브레인의 공극이 너무 작을 경우, 세포간 집적적인 접촉이 불가능하여서 수용액 내의 신호물질을 통한 교류만이 가능하여 세포간 상호작용을 극대화하는데 한계가 있다. 반면, 공극이 너무 클 경우는 세포간 교류는 활발하지만 세포간 이동으로 인해 분리효율이 떨어지며 이는 이종세포간 공배양에서 큰 문제점으로 작용할 수 있다. 따라서 세포간 상호작용과 분리효율이라는 두 가지 문제를 동시에 충족시킬 수 있는 최적의 공극의 크기를 찾아 줄기세포 분화에 적용하였다. 또한, 기상 개시 중합반응(initiated chemical vapor deposition, iCVD)을 이용하여 나노크기의 기공을 막지 않고 온도감응성 고분자를 나노 멤브레인의 표면에 증착시킴으로써 나노멤브레인에 온도감응 기능성을 부여하였다. 온도감응을 지니는 특성으로 인해 분화된 세포를 세포외 기질 물질의 파괴없이 시트 형태로 쉽게 얻어낼 수 있다. 이렇게 얻은 셀 시트는 이식 후 생존율을 높임으로써 개선된 치료효과를 기대할 수 있을 뿐만 아니라, 다층의 셀 시트를 구축함으로써 삼차원 형태의 분화된 세포구조를 얻을 수 있었다.

 

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

 

다공성 나노 멤브레인을 이용하여 세포간 상호작용을 극대화하여 분화효율을 높이는 방향으로 연구를 진행하였다. 하지만 이렇게 분화된 세포를 트립신 처리를 통해 수득할 경우 세포 생존율이 낮아 이식 후 좋은 효과를 기대할 수 없을 것이라 생각하였다. 따라서 기존에 잘 알려진 Okano 교수의 셀 시트처럼 분화된 세포를 시트형태로 떼어내고자 하였다. 이를 위해서는 멤브레인의 표면 개질이 필요하였다. 하지만 나노 크기의 수많은 기공을 갖는 다공성 멤브레인의 표면 구조를 해치지 않고 온도 감응성 고분자를 치환하는 것이 쉽지 않았다. 그러던 중 기상 개시 중합반응을 이용하여 다양한 나노구조에도 conformal하게 고분자를 증착시킬 수 있는 카이스트 실험실의 도움으로 멤브레인의 표면에 온도감응성 고분자를 증착할 수 있었고, 이를 통해 분화된 세포 시트를 얻음으로써 우리 플랫폼의 강점을 극대화할 수 있었다.

 

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

 

기존의 세포 공배양 시스템의 한계점을 극복하는 나노멤브레인을 개발하여 공배양에 적용함으로써 이종세포 간 혼합은 방지하면서 세포간 상호작용은 극대화하였다. 최적 조건의 나노멤브레인을 줄기세포와 쥐에서 추출한 심근세포의 공배양에 적용하여 효과적으로 줄기세포를 심근세포로 분화시켰다. 또한, 나노멤브레인의 표면에 온도감응성을 부여함으로써 다층의 세포 시트를 구현함으로써 이식 후의 높은 치료효과를 기대할 수 있다. 뿐만 아니라, 기공의 크기를 조절하여 세포간 주고받는 신호물질에서 세포간 직접적인 접촉까지 포함하는 나노스케일의 세포간 상호작용을 분석할 수 있는 플랫폼을 제공하였다는 점이 나노과학 분야에서 매우 괄목할만한 성과라 할 수 있다.

 

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

 

다양한 종의 세포를 줄기세포와의 공배양에 적용함으로써 특정 세포에 구애받지 않고 여러 종류의 다층 분화 세포 시트를 얻을 수 있기 때문에 줄기세포 치료에 적용될 수 있는 뛰어난 잠재력을 가지고 있다. 따라서 이 플랫폼을 각종 질병을 치료하는데 적용 가능해지길 바란다.

 

비용매 기체 상분리유도 방법으로 제작된 셀룰로즈 아세테이트 다공성 나노멤브레인

그림 1. 비용매 기체 상분리유도 방법으로 제작된 셀룰로즈 아세테이트 다공성 나노멤브레인. 왼쪽은 상분리 삼각 그래프와 상대습도에 따른 멤브레인의 표면 이미지를 나타내고, 오른쪽은 다양한 공정과정의 인자들(용액의 농도, 상대습도, 용매의 종류 등)을 변화시키며 얻을 수 있는 서로 다른 크기의 기공을 갖는 멤브레인의 표면 이미지를 보여준다.

 

NTHP　나노멤브레인을 이용하여 이종세포가 공배양되고 있는 모습

 

그림 2. NTHP　나노멤브레인을 이용하여 이종세포가 공배양되고 있는 모습. 본 연구에서 개발된 다공성 나노멤브레인은 두께가 수백 나노미터로 매우 얇아서 기존에 공배양에 사용되던 멤브레인(Transwell)에 비해 세포간 거리가 매우 가까운 것을 볼 수 있다. 따라서 신호물질 교환이 활발할 뿐만 아니라, 세포간 협간극 결합도 가능하다. 이렇게 활발한 세포간 상호작용이 가능한 동시에 오른쪽 유세포 분석(FACS) 결과에서 처럼 분리효율 또한 뛰어난 것을 확인할 수 있다.

 

온도감응성 NTHP 나노멤브레인을 이용한 세포 전사인쇄를 통한 다층 세포 시트의 구현 모식도

그림 3. 온도감응성 NTHP 나노멤브레인을 이용한 세포 전사인쇄를 통한 다층 세포 시트의 구현 모식도. 멤브레인의 표면에 온도감응성 고분자를 치환하여 저온(20°C)에서 세포가 NTHP 멤브레인으로 부터 세포외 기질물질의 파괴 없이 시트형태로 떨어진다. 위와 같은 방법을 반복하면 3차원 형태의 다층 세포 시트 구조체를 얻을 수 있다.

생명과학(한국연구재단 2015-11-13)